SUMOylation对SCA3/MJD转基因果蝇表型的影响及机制研究

【摘要】背景：脊髓小脑型共济失调3型(SCA3/MJD)是遗传性脊髓小脑型共济失调最常见亚型。其发病是由于致病基因MJD1编码区内3’端的CAG重复序列异常扩增导致其编码产物ataxin-3蛋白的羧基端多聚谷氨酰胺(polyglutamine,polyQ)肽链异常扩增引起。小泛素相关修饰物(smallubiquitin-relatedmodifier,SUMO)是新近发现的一类重要的蛋白质翻译后修饰因子。SUMO家族成员包括SUMO1、SUMO-2、SUMO-3、SUMO-4等至少四个家族成员,和泛素化类似,SUMOylation酶联反应需要SENP(Sentrin-specificproteases)、E1酶(SAE1/SAE2)、E2酶(Ubc9)、E3酶的参与。目前研究发现SUMO-1存在于帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、多系统萎缩、多聚谷氨酰胺疾病等多种神经退行性疾病的聚集体中。Smt3是SUMO在果蝇中的同源基因,lwr是Ubc9的同源基因。我们在前期研究中证实ataxin-3蛋白第166位赖氨酸(K166)为SUMO-1修饰野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白的关键氨基酸位点；进一步的体外实验证实阻断ataxin-3与SUMO-1的结合并不改变其亚细胞定位和经泛素化途径的降解,但影响了ataxin-3突变蛋白的稳定性及其细胞毒性,提示ataxin-3蛋白是SUMO-1的底物蛋白,苏素化修饰参与了SCA3/MJD的发病过程,但上述结果尚未得到体内实验的证实。目的：本研究拟利用转基因果蝇模型,进一步在体内实验中探讨SUMOylation对野生型和突变型SCA3/MJD转基因果蝇模型表型的影响；并对其可能的机制进行初步探讨。方法：1.去苏素化修饰对SCA3/MJD转基因果蝇模型表型的影响及可能机制1)利用基因重组技术、定点突变技术构建pUAST-attB-SCA3-Q27、pUAST-attB-SCA3-Q27-K166R、pUAST-attB-SCA3-Q84和pUAST-attB-SCA3-Q84-K166R转基因果蝇质粒；应用转基因果蝇定点插入技术,以white标记进行基因筛选,得到野生型、polyQ扩展突变型和相应苏素位点突变的SCA3/MJD转基因果蝇品系。2)在果蝇复眼或神经系统中启动MJD1基因的表达,研究ataxin-3去苏素化修饰对SCA3/MJD转基因果蝇模型表型的影响,包括复眼结构、孵化率、雌雄比例、寿命、翅膀异常比例、爬行速度等的影响。3)应用Westernblot技术检测去苏素化修饰对SCA3/MJD转基因果蝇模型中ataxin-3水平及Smt3水平的影响。2.下调SUMOylation通路对SCA3/MJD转基因果蝇模型表型的影响及可能机制1)应用Westernblot技术检测SCA3/MJD转基因果蝇模型中Smt3水平的差异。2)利用果蝇染色体双平衡体系构建分别在复眼和神经系统中表达SCA3.fl-Q78的果蝇和在此基础上同时干扰Smt3的表达或表达具有显性负性效应的1wr蛋白的果蝇。3)下调SUMOylation通路后,对SCA3/MJD转基因果蝇模型表型的影响,包括复眼结构、孵化率、雌雄比例、寿命、翅膀异常比例、爬行速度等的影响。4)应用Westernblot技术检测下调SUMOylation通路对SCA3/MJD转基因果蝇模型中ataxin-3水平的影响。结果：1.去苏素化修饰对SCA3/MJD转基因果蝇模型表型的影响及可能机制1)构建了UAS-SCA3-Q27、UAS-SCA3-Q27-K166R,UAS-SCA3-Q84和UAS-SCA3-Q84-K166R四种SCA3/MJD转基因果蝇模型。2)在复眼中表达SCA3-Q27、SCA3-Q27-K166R、SCA3-Q84和SCA3-Q84-K166R后,果蝇复眼外形未见明显异常。在神经系统表达SCA3-Q27或SCA3-Q27-K166R后,其孵化率、雌雄比例、寿命、翅膀、爬行速度与正常对照无差异；在神经系统表达SCA3-Q84、SCA3-Q84-K166R后,和野生型果蝇比较,其孵化率降低、雌雄比例增大、寿命缩短、部分翅膀发育异常、爬行速度减慢,而在神经系统表达SCA3-Q84-K166R比SCA3-Q84孵化率更低、雌雄比例更大、寿命更短、翅膀发育异常比例更高、爬行速度更慢,其差异具有统计学意义(P<0.05)。3)神经系统表达SCA3-Q27、SCA3-Q27-K166R,ataxin-3均呈SDS可溶性状态,其ataxin-3水平无明显差异,且无聚集体形成,其苏素化水平与正常对照相比无明显差异；表达SCA3-Q84、SCA3-Q84-K166R后,ataxin-3可形成SDS不可溶性聚集体,且后者SDS不可溶性ataxin-3水平更高,其苏素化水平降低,提示SCA3-Q84去苏素化修饰后,稳定性更强,更易形成聚集体。2.下调SUMOylation通路对SCA3/MJD转基因果蝇模型表型的影响及其可能机制1)在神经系统表达SCA3.fl-Q27或SCA3.fl-Q78,elav-GAL4/+;UAS-SCA3.fl-Q27/+组与正常对照组比较,Smt3水平无明显差异,而elav-GAL4/+;UAS-SCA3.fl-Q78/+组,Smt3水平明显增高,主要和SDS不可溶性蛋白共存。2)在果蝇复眼中下调SUMOylation通路后,gmr-GAL4/+;UAS-SCA3.fl-Q78/+复眼表型加重,色素脱失更加明显；在神经系统中下调SUMOylation通路后,elav-GAL4/+;UAS-SCA3.fl-Q78/+果蝇寿命缩短,爬行速度减慢。3)Westernblot检测显示,下调SUMOylation通路后,SDS不可溶性ataxin-3水平增高,提示其表型加重可能与ataxin-3聚集体水平增高相关。结论：1.K166位点突变后,扩展突变型SCA3/MJD转基因果蝇模型表型加重,孵化率降低、雌雄比例增大、寿命缩短、部分翅膀发育异常、爬行速度减慢,提示ataxin-3蛋白的苏素化修饰对SCA3/MJD转基因果蝇模型具有保护作用。2.K166位点突变后,扩展突变型ataxin-3毒性增强与去苏素化修饰后其稳定性增加,更易形成SDS不可溶性聚集体相关。3.扩展突变型SCA3/MJD转基因果蝇模型中,其Smt3水平增高,再次提示SUMOylation参与了对突变型ataxin-3毒性的调节。4.下调苏素化通路后,SCA3/MJD转基因果蝇模型复眼表型更重,寿命缩短,爬行速度减慢,提示苏素化通路对SCA3/MJD转基因果蝇模型具有保护作用。5.下调苏素化通路后,SCA3/MJD转基因果蝇模型表型加重与ataxin-3稳定性增加,更易形成SDS不可溶性聚集体相关。
【作者】罗莹莹；
【导师】唐北沙；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】SUMO-1；SUMOylation；脊髓小脑型共济失调；转基因果蝇；ataxin-3；SCA3/MJD；

【参考文献】
[1]任舒燕.展毛翠雀花根部生物碱的提取及抑菌试验[D].大连工业大学,发酵工程,2009,硕士.
[2]王永剑.革命叙事的延续与跌宕[D].南京师范大学,中国现当代文学,2012,硕士.
[3]刘明莹.电针百会—大椎穴治疗创伤后应激障碍的疗效观察[D].黑龙江中医药大学,针灸推拿学（专业学位）,2014,硕士.
[4]盛万兴,史常凯,孙军平,张波,仉天舒.智能用电中自动需求响应的特征及研究框架[J].电力系统自动化,2013,23:1-7.
[5]包希日莫,张璟,李军怀,张杰.一种改进的关系数据数字水印算法[J].计算机应用,2005,12:43-47.
[6]王惠良.智能导览系统的设计与实现[D].河北经贸大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[7]李业华.蒙古国留学生成语使用偏误分析及教学策略[D].内蒙古师范大学,汉语国际教育（专业学位）,2013,硕士.
[8]熊冬情.基于Ansoft的爪极发电机参数计算及优化[D].西南交通大学,电气工程,2012,硕士.
[9]伍力.重庆市公共图书馆服务体系构建研究[D].西南大学,马克思主义基本原理,2012,硕士.
[10]蔡梦玲.职务犯罪死刑适用研究[D].西南政法大学,刑法学（专业学位）,2012,硕士.
[11]岳学晨,王效人,贺锐岗,康龙维,于淑芬.降低铅锌精矿含杂的途径[J].有色金属(选矿部分).1992(05)
[12]王红红.关于英语教学专业批判性思维能力和课堂提问关系之研究[D].河北师范大学,学科教学,2012,硕士.
[13]田玉平.具有多非线性和多未建模动态系统的鲁棒绝对稳定性[J].自动化学报,1998,01:18-25.
[14]陈志.旋前型踝关节骨折不同外固定体位疗效研究[D].福建中医药大学,中医骨伤科学（专业学位）,2013,硕士.
[15]CRCC首席专家王广宇高级顾问江鹏程蓝一.决策支持需求驱动[N].计算机世界,2003-02-17D06.
[16]李静.沪、渝房产税改革视野下纳税人权利保护研究[D].中南民族大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[17]施黎敏.基于利益相关者理论的节能生态型住区规划设计研究[D].浙江大学,建筑与土木工程（专业学位）,2012,硕士.
[18]李健.“一题多解”与“多题一解”在高中数学教学中的价值研究与实践[D].苏州大学,教育（专业学位）,2012,硕士.
[19]荆凡静.儿童及青少年分化型甲状腺癌的侵袭特征及远处转移相关机制研究[D].青岛大学,肿瘤学,2013,硕士.
[20]邹琦.事件式营销（EBM）在工行的实践探讨[D].厦门大学,工商管理（EMBA）,2014,硕士.
[21]肖红.三维网络游戏引擎的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[22]胡启林.基于有限元分析的粘弹性阻尼器设计及建模研究[D].哈尔滨工业大学,控制科学与工程,2014,硕士.
[23]张琪.含酞菁高分子材料的制备及其非线性光学性能的研究[D].长春理工大学,2014.
[24]岑礼昌.双向可控硅交直流多用调压装置[J].冶金自动化,1980,03:57-60.
[25]廖神送.有杆泵深抽系统优化及泵深界限仿真研究[D].燕山大学,机械设计及理论,2014,硕士.
[26]纪慧颖.石墨烯及聚苯胺/石墨烯复合材料的制备及其电化学性质[D].燕山大学,2012.
[27]王文瑞.技术引领未来,科技创造效益——全国冶金自动化、信息化技术论坛暨全国冶金自动化信息网2014年年会[J].冶金自动化,2014,05:73-75.
[28]李宏喜.吉林油田XM油田地面集输系统优化研究[D].吉林大学,工业工程,2014,硕士.
[29]来玲,杨宝森.用Web挖掘方法扩充大学图书馆知识库研究[J].情报杂志,2005,02:18-20.
[30]牛建伟,王刃,李波.基于零树和位平面的小波图像压缩算法[J].软件学报,2002,03:460-466.
[31]戴竟.《命案目睹记》翻译报告[D].重庆大学,翻译（专业学位）,2014,硕士.
[32]李芝.阻燃羊毛纤维的热特性研究（K_2MF_6系列）[D].河北大学,高分子化学与物理,2003,硕士.
[33]郭宇.微博媒介生态环境中的信息污染问题探析[D].河北大学,传播学,2014,硕士.
[34]田晓丹.网络游戏外挂软件侵权责任分析[D].兰州大学,民商法（专业学位）,2013,硕士.
[35]罗民,丁肖怡,窦元运,赵亮,梁斌,梁军.浓硫酸脱水还原制备石墨烯及其电容性能[J].无机化学学报,2015,01:54-60.
[36]周涛.基于反双曲正弦函数的跟踪微分器[J].控制与决策,2014,06:1139-1142.
[37]周正伟.营口电厂二期扩建工程投资管控研究[D].吉林大学,项目管理,2013,硕士.
[38]郜峰.球磨机负荷监测软件平台的设计与开发[D].东北大学,控制理论与控制工程,2010,硕士.
[39]王刚.泵站进、出水流道优化水力设计方法研究[D].扬州大学,农业水土工程,2012,硕士.
[40]王玲玲.汉俄语音对比分析及对俄汉语语音教学策略[D].吉林大学,语言学及应用语言学,2014,硕士.
[41]倪冲.从电子加工行业产生的混合废酸中回收乙酸的方法和机理研究[D].中南民族大学,分析化学,2013,硕士.
[42]周光俊,龙太江.网络社团研究述评与展望[J].浙江万里学院学报,2014,04:48-52.
[43]奇安.印尼电力产能综合资源战略规划[D].清华大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[44]付晓露.奈保尔作品中的后殖民话语分析[D].南昌航空大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[45]李娟娟.石墨烯的成膜、修饰与电容性能的研究[D].南京邮电大学,2011.
[46]王新刚.基于平面螺旋电感耦合的小功率微波微等离子体的特性研究[D].华东师范大学,电磁场与微波技术,2013,硕士.
[47]王平.基于GIS的物流企业CRM系统的研究与开发[D].河北工业大学,2004.
[48]张坤.斗轮机上部机构与门座的有限元分析与优化设计[D].中南林业科技大学,机械工程,2014,硕士.
[49]涂希言.非正式权力的正式运作：公共品下乡的困境与实践[D].华中科技大学,社会学,2013,硕士.
[50]谢晓彪.不同预紧力影响下高强螺栓摩擦型连接的有限元分析及试验研究[D].南昌大学,力学,2014,硕士.